Selección y validación de genes endógenos normalizadores de la expresión de genes de interés a partir de transcriptomas de estadios tempranos del desarrollo de Paralichthys adspersus

Abstract

El lenguado fino Paralichthys adspersus, de alto valor comercial por su cotizada carne, afronta diferentes problemas durante las primeras etapas de su desarrollo relacionados a malformaciones y altas tasas de mortalidad; por lo que la aplicación de técnicas moleculares para la mejora en su cultivo resulta importante a fin de satisfacer su gran demanda. En este sentido, el trabajo buscó seleccionar y validar genes endógenos para la normalización de genes de interés en los primeros estadios de desarrollo de P. adspersus. Estos genes han sido identificados en datos de transcriptomas y seleccionados considerando valores de expresión diferencial in silico. Así, se evaluaron cinco genes candidatos a endógenos, como codificantes de la proteína ribosomal 40S S4 (RPS4/40S-RP), proteína ribosomal 60S P2 (RPP2/60S-RP), factor de elongación alfa 1a1 (EEF1A1), proteína ribosomal 40S S30 (FAU) y b-actina (bAct); y cinco genes relacionados al desarrollo como, la proteína parecida a formina 1 (Form1) y forkhead box protein B1 (Foxb1) y al crecimiento BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3-like (BCL2), Osteocalcina (Osteo) y proteína 5 de unión al factor de crecimiento parecido a insulina (IGFbp5). Se diseñaron cebadores específicos para siete genes, excepto FAU, bAct e IGFbp5. Los análisis de validación se realizaron utilizando cDNAs obtenidos de ejemplares de 20, 40, 60 y 90 dpe (n=10 por estadío). Las evaluaciones de eficiencias de amplificación de cada marcador se realizaron para todos los genes. Los valores Ct analizados utilizando tres algoritmos estadísticos (geNorm, NormFinder y Bestkeeper) permitieron calcular la estabilidad de cada gen, donde la combinación de 40S-RP + 60S-RP + bAct resultó ser la más estable. El perfil de los genes relacionados al desarrollo (Form1 y Foxb1) mostró una sobreexpresión en el grupo pre metamórfico (20 dpe), opuesta a los relacionados al crecimiento (BCL2, IGFbp5, Osteo) quienes se sobreexpresaron durante y luego de la metamorfosis (40, 60 y 90 dpe). Los perfiles de expresión de ciertos genes de interés cambiaron significativamente (p valor < 0.05) al normalizarlos con genes inestables (FAU + EEF1A1). Finalmente, los genes evaluados son los primeros marcadores reportados para P. adspersus resultando potenciales para ser utilizados su monitoreo durante estadios tempranos.

ABSTRACT: The fine flounder Paralichthys adspersus, with high commercial value due to its valued meat, faces different problems during the early stages of its development, related to malformations and high mortality rates; so the application of molecular techniques for the improvement in its culture is important in order to satisfy its great demand. In this sense, this work sought to select and validate endogenous genes for the normalization of genes of interest during early development stages of P. adspersus. These genes have been identified from transcriptomes considering in silico differential expression values. Therefore, five endogenous genes candidates were evaluated, as coding 40S ribosomal protein S4 (40S-RP), 60S ribosomal protein P2 (60S-RP), elongation factor 1a1 (EEF1A1), 40S ribosomal protein S30 (FAU) and beta actin (bAct); and five genes related to development, as formin-like protein 1 (Form1) and forkhead box protein b1- like (Foxb1); and to growth as BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3-like (BCL2), osteocalcin (Osteo) and insulin-like growth factor binding protein 5 (IGFbp5). Specific primers were designed for seven genes, except for FAU, bAct and IGFbp5. Validation analyzes were performed using cDNAs obtained from specimens of 20, 40, 60 and 90 dph (n=10 per stage). Amplification efficiency evaluations of each marker were performed for all genes. The Ct values analyzed using three statistical algorithms (geNorm, NormFinder and Bestkeeper) allowed calculating the stability of each gene, where the combination of 40S-RP + 60S-RP + bAct turned out to be the most stable. The profile of the genes related to development (Form1 and Foxb1) showed an overexpression in the pre-metamorphic group (20 dph), in contrast to those related to growth (BCL2, IGFbp5, Osteo) which were overexpressed during and after metamorphosis (in 40, 60 and 90 dph). Furthermore, was observed significant changes (p value < 0.05) in the expression profiles of certain genes of interest when were normalized with unstable genes (FAU + EEF1A1). Finally, the evaluated genes are the first markers reported for P. adspersus, resulting potential for monitoring during early stages.